Пн. - Сб. с 9:00 до 21:00      Мы в

В данной главе приведены примеры современных исследований различных аспектов отклика живых биологических клеток на рельеф, структуру и физико-химические свойства поверхности металлов.

Рассматриваются, в первую очередь, эксперименты in vitro поведения костных клеток с учетом состояния поверхности металлических образцов и реальных имплантатов. Такие состояния формируются путем различных механических, химических и биофизических обработок. Детальное исследование различных проявлений поведения костных клеток (остеобластов, остеокластов и др.) и молекул является важным экспериментальным этапом, необходимым для более глубокого понимания атомных и молекулярных механизмов процессов остеоинтеграции в организме человека. Именно этим интересом можно объяснить проведение огромного количества лабораторных исследований в этом направлении во всех развитых странах в последнее десятилетие. При этом привлекается большой арсенал количественных биологических, физиологических и физико-химических методов анализа состояния металлических поверхностей после разнообразных воздействий как до, так и после выдержки в клеточной культуре. Ниже приведен ряд наиболее типичных работ, посвященных исследованию поведения костеобразующих клеток на поверхности металлов после различных обработок.

2.1. Механически обработанные поверхности

Систематические исследования in vitro, проведенные в последние годы, показали, что костные клетки (остеобласты) определенным образом реагируют на характер поверхностного рельефа титана. В данном разделе рассмотрены примеры, подтверждающие этот вывод. Существенный рост количества прикрепленных клеток остеобластов был обнаружен в случае рельефной поверхности титана с нерегулярной морфологией [13 - 17]. Усиление такой важной характеристики биосовместимости, как щелочно-фосфатная активность, обнаружено для рельефной поверхности титана и сплава Ti6Al4V [18,19]. Исследованию поведения клеточных культур на поверхности титана с различной текстурой, полученной в результате различных обработок, посвящена работа [20]. Титановые образцы подвергались следующим видам обработок: механической глянцевой шлифовке; воздушной пескоструйной обработке порошком оксида алюминия (250 мкм) при давлении воздуха 3 - 4 бар; плазменному нанесению титанового порошка (50 - 100 мкм), формирующему модифицированный слой толщиной до 30 - 50 мкм с величиной рельефа около 15 мкм. Установлено, что для эпителиальных клеток десны наилучшая адгезия, более высокая скорость размножения и распространения клеток характерна для полированной поверхности (рис. 2.1).

В этом отношении худшей поверхностью характеризуется образец, обработанный плазмой. С другой стороны, адгезия и рост кератиноцитов десны наблюдались только на полированной плазменнообработанной поверхности и не отмечались на поверхности после пескоструйной обработки. В противоположность этому, поведение остеобластов не зависело от состояния поверхности титана. Таким образом, по результатам данной работы сделан вывод о том, что мягкие ткани более чувствительны к поверхностной текстуре, чем твердые.

Влияние рельефа поверхности на поведение клеток костного мозга человека при одинаковом характере регулярной морфологии поверхности сплава Ti6Al4V изучено авторами [21]. В данном исследовании поверхностный рельеф создавали шлифованием на бумаге с частицами карбида кремния различного размера (1200, 600 и 180 грит). Параметр шероховатости Ra для разных состояний поверхности равнялся 0,32; 0,490 и 0,874 мкм, соответственно. Расстояния между царапинами составляли 3; 3,75 и 5 мкм для трех групп образцов, соответственно. Характер рельефа поверхности титана в зависимости от размера частиц карбида кремния приведен на рис. 2.2.
 
В данной работе было показано, что адгезия и размножение исследованных клеток усиливаются с увеличением шероховатости поверхности (рис. 2.3). 

Этот факт объясняется различной степенью адсорбции протеинов на гладкой и рельефной поверхности подложки.
Детальное исследование влияния различных видов поверхностной обработки на состояние поверхностного рельефа и на адгезию остеобластов выполнено в работе [22]. При этом создавались два типа неупорядоченного рельефа, с точки зрения его масштаба: 1) амплитуда рельефа больше размера клетки (макрорельеф); 2) амплитуда рельефа меньше размера клетки (микрорельеф). Образцы из технически чистого титана и сплава Ti6Al4V подвергались следующим обработкам: 1) механической (М); 2) электро-эрозионной (ЭЭ); 3) полировке (П). 

С помощью механической обработки получали поверхности с канавками шириной 150 - 200 мкм (Ra = 3 - 3,5; 1 - 3; 0,3 -1 мкм). Аналогичные параметры рельефа имели образцы и после электроэрозионной резки. Полировку осуществляли на наждачных бумагах на основе карбида кремния и с помощью алмазной пасты (Ra = 0,3 - 1 мкм). Такие обработки позволяли получать изотропную и анизотропную морфологию поверхности с различными параметрами шероховатости и фрактальной размерности. Систематический анализ поведения остеобластов в зависимости от морфологии и рельефа показал, что их адгезия убывает в следующей последовательности видов обработки: ЭЭ (изотропная рельефная поверхность) > М (рельефная анизотропная поверхность) > П (изотропная гладкая полированная поверхность) > М (анизотропная гладкая поверхность).

Кроме того, клетки более эффективно реагируют с рельефной поверхностью, величина шероховатости которой больше размера клеток (рис. 2.4). 

Таким образом, ЭЭ обработка является перспективной для подготовки биосовместимой поверхности титана и его сплава. В последние годы большой интерес представляют исследования биосовместимых свойств наноструктурных металлических материалов. Например, авторами [23] исследовались металлические образцы с наноразмерными зернами, полученными путем холодного прессования наноразмерных порошков Ti, сплавов Ti6Al4V и CoCrMo.
В данной работе впервые показано, что нанокристаллические металлические материалы независимо от их химического состава характеризуются повышенной адгезией остеобластов (в 1,5 - 2 раза) по сравнению с материалами, полученными путем обычной технологи (рис. 2.5, 2.6).

Экспериментально установлено, что остеобласты осаждаются на межзеренных границах, протяженность которых в нанокристаллических материалах существенно больше, чемв материалах с микронными зернами.

Особый интерес представляет исследование поведения генов остеобластов в зависимости от шероховатости титановой поверхности [24]. В данной работе исследовали три способа обработки поверхности технически чистого титана: механическую полировку (рис. 2.1, а), воздушную пескоструйную обработку после химического травления (рис. 2.1, б) и плазменное распыление (рис. 2.1, в). 

Параметр поверхностного рельефа Ra образцов титана после каждой обработки составлял, соответственно: 0,6; 4,0 и 5,2 мкм. Существенного отличия в химическом составе поверхности титановых образцов после различных обработок не было обнаружено. В качестве живыхклеток использовались человеческиостеобласты. 

На рис. 2.7 приведена номограмма, характеризующая количество данных клеток после определенного инкубационного периода для разных состояний поверхности титановых образцов. Как видно из этого рисунка, количество клеток растет быстрее на более рельефной поверхности, т.е. после плазменной обработки.

Эксперименты также показали более интенсивную экспрессию генов остеобластов на такой поверхности. C целью исследования влияния рельефа поверхности титана на взаимодействие его с клетками после разнообразных модифицирующих воздействий в работе [25] применяли следующие способы обработки поверхности: полировку (П) порошком карбида кремния (4000 грит), обработку на токарном станке (М) без последующей обработки поверхности, воздушную пескоструйную обработку (GB) порошком стекла (180—300 мкм), порошком оксида алюминия (500—600 мкм).

Соответствующая величина рельефа обработанной поверхности Ra была равной 0,19; 0,54; 1,22; 6,07 мкм. Однако кроме рельефа на поведение клеток могут оказывать влияние и особенности морфологии обработанной поверхности. Электронно-микроскопический анализ показал, что на полированной поверхности видны только небольшие и слабо видимые царапины; после механической обработки видны относительно длинные канавки; после воздушной пескоструйной обработки присутствуют относи тельно гладкие и рельефные участки, содержащие ямки различных размеров. В качестве живых клеток использовались человеческие клетки остеосаркомы MG-63. Маркером мест их очаговой адгезии были нанесенные на поверхность металла цитоскелетные протеины.

В зависимости от состояния поверхности титана анализировали количество, размеры и скорость формирования очагов адсорбции клеток (рис. 2.8, 2.9). Приведенные гистограммы демонстрируют влияние способа поверхностной обработки на характеристики адгезии клеток. Более детально влияние рельефа на дифференциацию клеток изучено в работе [26]. Исследованы образцы технически чистого титана после механической обработки (M, Ra = 0,68 мкм) и воздушной пескоструйной обработки с различным размером порошка оксида алюминия: 50 мкм (S1, Ra = 1,012 мкм ), 75 мкм (S2, Ra = 1,443 мкм), 125 мкм (S3, Ra = 2,139 мкм) и 250 мкм (S4, Ra = 3,217 мкм) (рис. 2.10).

Исследования показали, что приросте остеобластов типа MG63 на S4-образце щелочно-фосфатная активность оказалась в пять раз выше по сравнению с образцом М. Таким образом, активность уровня протеина в клетках MG63 существенно повышается с увеличением шероховатости поверхности титана.
Недостатком пескоструйной подготовки шероховатых поверхностей с использованием частиц Al2O3 или SiC является загрязнение поверхности имплантата абразивными частицами, которые могут оказывать нежелательные эффекты при их растворении в костной ткани [27]. Недавно было предложено [28] использование в качестве абразивных частиц на основе биоактивных материалов, в частности, ГКА и бета-трикальцийфосфата, либо смеси этих частиц. Механически полированные диски из сплава Ti6 Al4V (Ra = 0,17 мкм) обрабатывали смесью частиц ГКА и бета - трикальцийфосфата (ВСР) всоотношении 75/25 и размером частиц 41 мкм. Режим пескоструйной обработки был следующим: расстояние от сопла до образца 10 - 15 см; давление воздуха 8 бар; время обработки 5 мин. 

После пескоструйной обработки образцы подвергались пассивации в 26 % растворе азотной кислоте при комнатной температуре. Параметр шероховатости поверхности после указанной обработки Ra = 1,57 мкм. Часть образцов после механической полировки протравливалась в 26 % растворе азотной кислоты в течение 1 ч при комнатной температуре (Ra = ,58 мкм). Исследовали поведение остеобластов типа МС3Т3-Е1 (мыши) на поверхностях титана с различной обработкой. Измеряли митохондриальную и фосфатную активность клеток. Показано, что обработка частицами, содержащими кальций, делает поверхность сплава нетоксичной по отношению к остеобластам и позволяет получать оптимальную величину шероховатости поверхности.

Шероховатые поверхности могут быть получены также методом порошковой металлургии [29]. В данной работе исследовано влияние поверхностной топографии образцов из технически чистого титана и сплавов Ti6 Al4V, CoCrMo на метаболическую активность человеческих остеобластов. Исходные порошки металлов имели два типа размера: микро- и нанометровые. Образцы были компактированы под высоким давлением при комнатной температуре. 

Эксперименты показали, что осаждение Са и Р под влиянием остеобластов протекает наиболее интенсивно на поверхности наноструктурного образца, по сравнению с обычным состоянием металла. Наибольший эффект получен на образцах, изготовленных из сплава CoCrMo. 

Возможности лазерной технологии для создания оптимального рельефа поверхности имплантатов рассмотрены авторами [30]. В данном исследовании для модификации рельефа и текстуры поверхности сплава Ti6Al4V использовался YAG:Nd лазер с параметрами: λ=1064 нм, длительность импульса 100 нс, частота 10 Гц, энергия в импульсе до 500 мДж, мощность 35 Вт, плотность потока 106 мДж/см2 (существенно выше температуры плавления сплава). Для исключения окисления металла обработка производилась в атмосфере инертного газа аргона. 

С помощью лазерного луча формировалась морфология поверхности с различным размером ямок и расстояний между ними. Диаметр ямок (при глубине 0,5 мкм) равнялся 156 мкм (образец 1), 214 мкм (образец 2) и 374 мкм (образец 3); расстояния между ними по оси х и оси у равнялись 490, 627, 374 мкм и 510, 544, 555 мкм, соответственно. 

Усредненный параметр шероховатости Ra между ямками для образцов 1, 2 и 3 составлял 6,50; 13,54 и 5,21 мкм, соответственно. Для исходного образца (после воздушной пескоструйной обработки) Ra=2,32 мкм. Исследовалось поведение клеток остеобластов типа 2Т3 (рис. 2.11) для различного состояния поверхности. Концентрация остеобластов для разных образцов приведена на рис. 2.12. 

После 2 часов выдержки наибольшее количество клеток наблюдалось на образце 3. Большая часть остеобластов располагалась в ямках. Корреляции в поведении клеток в зависимости от шероховатости в данном исследовании не установлены.

В последние годы исследуется эф- фективность применения пористых титановых имплантатов в качестве заменителей твердых тканей человека. Такие имплантаты получают путем высокотемпературного спекания в вакууме титановых порошков или титановых волокон [13]. После имплантации материалов новая костная ткань прорастает в поры имплантата и таким образом, повышает силу сцепления между металлом и естественной костью [14].